Nghiên cứu thực vật thường liên quan đến việc trồng cây mới trong môi trường được kiểm soát. Đây có thể là những cây mà chúng ta đã biến đổi gen theo một cách nào đó hoặc có thể là những cây mà chúng ta cần nhiều bản sao hoàn toàn giống nhau. Những điều này có thể được thực hiện thông qua nuôi cấy mô của các mảnh mô nhỏ từ cây quan tâm. Những mảnh nhỏ này có thể đến từ một cây mẹ đơn lẻ hoặc chúng có thể là kết quả của quá trình biến đổi gen của các tế bào thực vật đơn lẻ sau đó được khuyến khích phát triển và cuối cùng phát triển thành một cây hoàn chỉnh. Kỹ thuật nuôi cấy mô thường được sử dụng để sản xuất cây trồng thương mại cũng như nghiên cứu cây trồng.

Nuôi cấy mô liên quan đến việc sử dụng các mẩu mô thực vật nhỏ (mẫu cấy) được nuôi cấy trong môi trường dinh dưỡng dưới vô trùng điều kiện. Sử dụng các điều kiện sinh trưởng thích hợp cho từng loại mẫu cấy, cây có thể được kích thích để nhanh chóng tạo ra các chồi mới, và với việc bổ sung các loại kích thích tố thích hợp sẽ tạo ra rễ mới. Những cây con này cũng có thể được phân chia, thường là ở giai đoạn chồi, để tạo ra một số lượng lớn cây con mới. Các cây mới sau đó có thể được đặt trong đất và phát triển bình thường thái độ.

Nhiều loại cây thích hợp sử dụng trong lớp học. Súp lơ, cành hoa hồng, lá violet châu Phi và cành hoa cẩm chướng đều sẽ dễ dàng tạo ra nhân bản (bản sao di truyền chính xác) thông qua nuôi cấy mô. Hoa súp lơ nói riêng cho kết quả tuyệt vời vì chúng có thể phát triển thành cây hoàn chỉnh trong môi trường nuôi cấy mô cơ bản mà không cần thêm kích thích tố tăng trưởng hoặc kích thích rễ. Chồi xanh thường có thể quan sát được trong vòng ba tuần và rễ phát triển trong vòng sáu tuần.

Tuy nhiên, phần quan trọng nhất của hoạt động này là duy trì môi trường càng vô trùng càng tốt. Ngay cả một bào tử nấm hoặc tế bào vi khuẩn tiếp xúc với môi trường tăng trưởng cũng sẽ nhanh chóng sinh sản và nhanh chóng lấn át hoàn toàn mẫu thực vật nhỏ mà bạn đang cố gắng nhân bản.

Nguyên vật liệu

• 1 lọ phương tiện truyền thông Murashige Skoog (MS). (Nếu bạn muốn tạo giá thể trồng trọt của riêng mình, bạn có thể sử dụng công thức cho giá thể Murashige được cung cấp ở cuối phần này.)
• 1 L nước cất vô trùng 10 g thạch/L
• 30 g sucrose/L
• Bình chứa 1,5 L hoặc 2 L để chuẩn bị môi trường nuôi cấy
• Một lượng nhỏ NaOH 1M và HCl 1M để điều chỉnh pH của môi trường 60 ống nuôi cấy đáy phẳng có nút đậy.
• Bể thủy tinh hoặc hộp lót bằng nhựa Tấm nhựa để che phía trên bể cá Băng dính
• 10% Thuốc tẩy trong bình xịt Cồn 70% trong bình xịt Kẹp hoặc nhíp
• Găng tay
• Thiết bị cắt như lưỡi dao mổ hoặc lưỡi dao cạo
• 2 chai nước cất tiệt trùng (mua ở siêu thị)
• Nồi áp suất
• Khăn giấy loại cây bạn chọn (súp lơ, hoa hồng, hoa violet châu Phi hoặc cẩm chướng) để cắt hoặc đĩa petri vô trùng nếu có Cốc hoặc lọ để rửa nguyên liệu thực vật
• Hỗn hợp chất tẩy rửa-nước – 1ml chất tẩy rửa trên một lít nước
• Dung dịch khử trùng thuốc tẩy – pha loãng thuốc tẩy thương mại (5-6% natri hypochlorite) đến nồng độ cuối cùng là 1-2% natri hypochlorite trong nước cất đựng trong cốc hoặc lọ lớn.
• 2 hoặc 3 cốc hoặc lọ nước vô trùng
• Khu vực đủ ánh sáng, tránh ánh nắng trực tiếp hoặc sử dụng đèn chiếu sáng toàn quang phổ Các kích thích tố như BAP (benzylaminopurine) và NAA (axit naphtalen axetic) để kích thích sinh trưởng và phát triển rễ, tương ứng. (Bột và dung dịch kích thích tố ra rễ thương mại cũng có sẵn từ phần cứng cửa hàng.)

Các bước tiến hành

Chuẩn bị và khử trùng môi trường nuôi cấy(khi không được pha sẵn)

Các bước này sẽ tạo ra 1L môi trường nuôi cấy đủ để chuẩn bị cho khoảng 65 ống nuôi cấy.

1. Hòa tan hỗn hợp MS trong khoảng 800 ml dung dịch chưng cất Nước.     Khuấy nước liên tục trong khi thêm hỗn hợp muối. Cho 30 g đường vào khuấy tan. Điều chỉnh pH đến 5,8 bằng NaOH 1M hoặc HCl 1M khi cần trong khi khuấy nhẹ. Thêm nước cất để làm cho tổng thể tích lên đến 1 l.
2. Cân 10 gam agar và cho vào dung dịch MS. Đun nhẹ dung dịch trong khi khuấy cho đến khi tất cả thạch đã giải thể.
3. Đổ môi trường vẫn còn ấm vào các ống polycarbonate đến độ sâu khoảng 4 cm sẽ sử dụng khoảng 15ml môi trường cho mỗi ống.
4. Đặt các ống (có nắp đậy trên ống nhưng không vặn chặt) vào nồi áp suất và khử trùng trong 20 phút. Để nguội nồi áp suất, sau đó tháo các ống và vặn chặt nắp. Ngoài ra, các ống có thể được đặt trong nước sôi trong 30 phút, nhưng đảm bảo rằng không có nước nào có thể lọt vào ống. ống.

LƯU Ý: Nếu bạn muốn sử dụng các loại thực vật khác ngoài súp lơ, bạn cần chuẩn bị hai môi trường khác nhau có chứa các hormone thực vật cần thiết để kích thích sự phát triển của các mô biệt hóa. Loại thứ nhất nên chứa một loại cytokinin như BAP để thúc đẩy sự hình thành chồi và loại thứ hai chứa một loại hormone tạo rễ như NAA hoặc loại hormone tạo rễ mua ở cửa hàng. Để làm điều này, hãy chuẩn bị hỗn hợp cho đến khi kết thúc bước 2. Giữ ấm hỗn hợp để không bị đông đặc, chia đều vào hai hộp đã được làm ấm trước. Mỗi hộp có thể dùng để pha chế khoảng 30 ống như trên. Bình chứa đầu tiên phải được bổ sung BAP với tỷ lệ 2,0mg/l. Bình chứa thứ hai phải được bổ sung hormone NAA với tỷ lệ 0,1 mg/L. Để làm điều này, cần pha dung dịch đậm đặc cả BAP (2,0 mg/ml) và NAA (1,0 mg/ml) và lọc khử trùng chúng. Thêm 1ml dung dịch gốc BAP đậm đặc hoặc 100 μl dung dịch gốc NAA đậm đặc vào mỗi 1 lít môi trường mà bạn chuẩn bị. Nếu bạn sử dụng kích thích tố ra rễ được mua từ cửa hàng cung cấp phần cứng hoặc vườn ươm tại địa phương thay vì NAA thì chỉ cần làm theo hướng dẫn trước khi thêm vào giá thể của bạn.

Chuẩn bị buồng chuyển và thiết bị vô trùng

Buồng chuyển lớp có thể làm từ bể cá thủy tinh sạch bật của nó bên Chà kỹ bể cá bằng dung dịch thuốc tẩy 30%, làm chắc chắn rằng bạn đeo găng tay và không hít phải khói. Rửa sạch bằng nước cất vô trùng, úp ngược trên mặt bàn sạch hoặc khăn giấy và để yên khô.

Cắt các lỗ trên tấm nhựa sạch để các cánh tay có thể thò vào trong buồng và gia cố các cạnh đã cắt bằng băng dính nếu cần. Dán tấm nhựa sạch lên mặt mở của bể cá để đảm bảo rằng các lỗ cần gạt được đặt ở độ cao thuận tiện. Các ống bọc nhựa cũng có thể được lắp vào các lỗ này nếu bạn muốn ngăn chặn sự xâm nhập của không khí dễ dàng hơn. bào tử thành các buồng.

Buồng nuôi cá đã hoàn thiện có thể được khử trùng bằng cách phun thuốc tẩy 10% chlorox ngay trước mỗi lần sử dụng và làm khô bằng giấy vô trùng cái khăn lau.

Bọc kẹp, dao mổ, lưỡi dao cạo, khăn giấy và găng tay (cao su hoặc găng tay dùng trong phẫu thuật) trong giấy nhôm, dùng băng keo dán kín và khử trùng bằng cách chế biến chúng trong nồi áp suất trong 20 phút.

Những vật dụng này cũng có thể được khử trùng bằng cách đặt trong lò nướng ở nhiệt độ 350^oF trong 15 phút. Bạn có thể bọc riêng từng món đồ hoặc đặt chung một “bộ dụng cụ” để mỗi học sinh sẽ có dụng cụ vô trùng riêng để sử dụng.

Ngoài ra, kẹp và lưỡi dao có thể được khử trùng bằng cách nhúng vào thuốc tẩy 10% rồi rửa trong nước vô trùng, hoặc nhúng vào cồn rồi hơ trên ngọn lửa, mặc dù cách này không được khuyến khích sử dụng trong lớp học đông người.

Nếu bạn chọn ngâm trong thuốc tẩy và rửa sạch trong nước vô trùng, tốt nhất là nên có sẵn dung dịch mới cho mỗi 3-4 học sinh vì nước có thể dễ bị nhiễm bẩn nếu không sử dụng cẩn thận. Các bình chứa chất lỏng này chỉ nên được mở khi chúng đã ở trong buồng vô trùng.

Chuẩn bị mẫu cây

Vật liệu thực vật của bạn trước tiên phải được khử trùng bề mặt để loại bỏ bất kỳ vi khuẩn hoặc bào tử nấm nào có mặt. Mục đích của chúng tôi là tiêu diệt tất cả các vi sinh vật, nhưng đồng thời không gây ra bất kỳ thiệt hại bất lợi nào cho nguyên liệu thực vật.

1. Súp lơ trắng nên được cắt thành những phần hoa nhỏ có bề ngang khoảng 1 cm. Nếu sử dụng hoa hồng hoặc cành giâm khác, hãy cắt chồi thành khoảng 5 đến chiều dài 7 cm. Toàn bộ lá violet châu Phi cũng có thể được đã sử dụng.
2. Rửa nguyên liệu thực vật đã chuẩn bị trong hỗn hợp nước-chất tẩy rửa trong khoảng 20 phút. Nếu thử chà vật liệu thực vật có lông bằng vải mềm bàn chải (bàn chải đánh răng). Điều này sẽ giúp loại bỏ nấm, v.v., và chất tẩy rửa sẽ giúp làm ướt vật liệu và loại bỏ bọt khí có thể bị mắc kẹt giữa các sợi lông nhỏ trên quần áo. thực vật.
3. Chuyển nguyên liệu thực vật đã rửa sạch sang khử trùng bằng cloroxit. Lắc hỗn hợp trong 1 phút rồi để ngâm trong 10- 20 phút. Cẩn thận đổ dung dịch thuốc tẩy bằng nắp để giữ cho mô thực vật không rơi ra ngoài và sau đó đậy nắp cẩn thận thùng đựng hàng.

Lưu ý 1: Tại thời điểm này, mô được coi là vô trùng. Tất cả các lần rửa tiếp theo phải được thực hiện bằng nước vô trùng và tất cả các thao tác trên mô được thực hiện bằng dụng cụ và vật tư vô trùng. Mở từng hộp một và không bao giờ mở nắp của bất kỳ hộp nào lâu hơn là cần thiết.

Lưu ý 2: Nhiều sinh viên sẽ không đánh giá đầy đủ tầm quan trọng của việc khử trùng cẩn thận các mẫu cấy và do đó sẽ có một số mẫu cấy bị nhiễm vi khuẩn hoặc nấm phát triển. Nếu bạn không muốn nhấn mạnh khía cạnh này của phòng thí nghiệm, sinh viên có thể được cung cấp nguyên liệu thực vật mà người hướng dẫn đã khử trùng trước khi lớp học sử dụng.

Chuyển nguyên liệu thực vật vào môi trường nuôi cấy mô

Sử dụng găng tay và thiết bị vô trùng cho tất cả các bước này.

1. Đặt nguyên liệu thực vật vẫn còn trong hộp khử trùng bằng thuốc tẩy chlorox, hộp đựng nước vô trùng, kẹp và lưỡi đã khử trùng, một ít khăn giấy vô trùng để sử dụng làm bề mặt cắt và đủ ống chứa môi trường vô trùng vào bể cá vô trùng. Bề mặt bên ngoài của vật chứa, ống có nắp và nhôm đồ dùng được bọc nên được phun cồn 70% trong thời gian ngắn trước khi chuyển chúng vào buồng.
2. Găng tay có thể được phun dung dịch cồn 70% và tay cọ xát với nhau để lan truyền rượu ngay trước khi đặt tay vào buồng. Sau khi học sinh đeo găng tay và phun thuốc, học sinh không được chạm vào bất cứ thứ gì bên ngoài khu vực khử trùng. buồng.
3. Cẩn thận mở hộp chứa nguyên liệu thực vật và đổ đủ nước vô trùng để đổ đầy một nửa hộp. Đậy nắp lại và lắc nhẹ hộp để rửa kỹ các mảnh mô (mẫu cấy) trong 2-3 phút để loại bỏ các chất tẩy trắng. Đổ bỏ nước và lặp lại quy trình giặt 3 lần nữa lần.
4. Lấy nguyên liệu thực vật đã khử trùng ra khỏi nước vô trùng, đặt lên khăn giấy hoặc đĩa petri vô trùng. Cắt súp lơ thành những miếng nhỏ có bề ngang khoảng 2 đến 3 mm. Nếu dùng hoa hồng cắt một đoạn thân khoảng dài 10 mm với một chồi đính kèm. Lá khôi tím Châu Phi bạn có thể cắt thành những miếng vuông nhỏ có bề ngang khoảng 1-1,5cm. Hãy chắc chắn tránh bất kỳ mô nào đã bị hư hại do thuốc tẩy, có thể thấy rõ qua màu nhợt nhạt của nó.
5. Lấy một phần nguyên liệu thực vật đã chuẩn bị sẵn trong kẹp vô trùng và đặt vào môi trường trong polycacbonat ống. Các miếng súp lơ nên ngập một phần trong môi trường, nụ hoa đối mặt hướng lên. Hoa hồng hoặc các cành giâm khác nên được đặt sao cho chồi ngang với bề mặt trung bình. Các mảnh lá violet châu Phi nên được đặt trực tiếp lên môi trường bề mặt.

• Đậy chặt nắp trên ống.

Hình 1: Mẫu cấy nhỏ phát triển mô sẹo, sau đó tạo chồi vài tuần sau khi được đưa vào nuôi cấy mô phương tiện truyền thông

Trồng cây

1. Các ống chứa các phần thực vật có thể được đặt ở nơi có ánh sáng tốt trong lớp học mặc dù không phải dưới ánh sáng mặt trời trực tiếp. Các chồi có thể sẽ phát triển nhanh hơn nếu các mẫu cấy được đặt dưới đèn huỳnh quang hoặc đèn tăng trưởng để cung cấp ít nhất 12 giờ ánh sáng mỗi ngày. Bể cá có thể được sử dụng như một buồng tăng trưởng với ánh sáng cao khoảng 8-10 inch trên đầu. Điều này cũng sẽ giúp duy trì nhiệt độ ấm và đều đặn hơn. Đảm bảo rằng nhiệt độ không vượt quá 28oC. Các chồi mới sẽ phát triển trong vòng 2 tuần và sẽ phát triển tốt trong 3 đến 4 tuần. Kiểm tra các ống hàng ngày và loại bỏ bất kỳ ống nào có dấu hiệu nhiễm trùng (trước khi loại bỏ, hãy khử trùng đầu tiên trong nồi áp suất hoặc thêm thuốc tẩy vào ống.
2. Rễ có thể xuất hiện trong vòng 6 tuần trên súp lơ. Hoa hồng, hoa violet châu Phi và các cành giâm khác sẽ cần được chuyển vào môi trường tạo rễ để rễ phát triển. đúng cách phát triển. Việc chuyển sang môi trường tạo rễ thứ hai phải được tiến hành trong cùng điều kiện vô trùng như khi bắt đầu các văn hoá. Tất cả các thiết bị cần thiết và hồ cá nên được thiết lập như trước và đúng cách tiệt trùng.
3. Thao tác bên trong buồng nuôi cá vô trùng, tháo nắp ra khỏi ống nuôi cấy. Thường sẽ có vài chồi phát sinh từ mỗi mẫu cấy. Những chồi này cần được tách cẩn thận bằng cách nhẹ nhàng lấy toàn bộ mẫu cấy ra khỏi môi trường bằng kẹp vô trùng và sau đó tách các chồi bằng cách nhẹ nhàng kéo chúng ra bằng hai cặp kẹp. Sau đó, mỗi chồi nên được đặt vào một ống chứa chất tạo rễ và phần dưới của chồi được đẩy vào trong chất trồng để tiếp xúc tốt. Nắp được thay thế và các chồi sau đó được phép phát triển như ở bước 1 cho đến khi rễ hình thành, thường trong vòng 2-3 tuần.

Bầu vô tính

Khi rễ đã hình thành tốt, cây đã sẵn sàng để chuyển vào đất.

Hình 2: Rễ phát triển đầy đủ trước khi chuyển cây sang bầu đất

1. Mỗi cây nên được lấy ra khỏi ống giá thể một cách cẩn thận và trồng vào chậu nhỏ có chứa hỗn hợp bầu sạch, nhẹ. Nhẹ nhàng rửa sạch tất cả môi trường thạch trước khi cấy. Cây vẫn cần được bảo vệ trong giai đoạn này vì chúng chưa quen với không khí khô hơn của lớp học khi so sánh với môi trường ẩm ướt trong ống nghiệm. phương tiện truyền thông.
2. Đặt tất cả các chậu lên khay và che nhẹ bằng mái vòm hoặc lều nhựa. Đặt cây ở nơi có 12-16 giờ ánh sáng (tự nhiên hoặc nhân tạo) nhưng không chiếu trực tiếp ánh sáng mặt trời.
3. Sau một tuần, lớp phủ có thể được dỡ bỏ dần dần và cây thích nghi với ánh sáng mạnh hơn và khí quyển khô hơn điều kiện.
4. Bây giờ bạn có một bộ sưu tập thực vật trong lớp học của mình hoàn toàn giống nhau về mặt di truyền. Bạn có thể sử dụng những cây này để thực hiện các thử nghiệm thử nghiệm khác khi biết rằng một trong những biến số chính trong thử nghiệm đã bị loại bỏ. Một số thử nghiệm này có thể bao gồm xem xét phản ứng của thực vật với mức độ ánh sáng yếu, hạn hán hoặc nhiễm mặn. điều kiện đất đai.

Câu hỏi liên quan

1. Nuôi cấy mô sử dụng một mảnh mô nhỏ từ cây mẹ để phát triển nhiều bản sao mới của cây ban đầu. thuật ngữ được sử dụng để chỉ mảnh nhỏ này là gì mô?
2. Một số loại cây mà chúng ta có thể sử dụng cho mô là gì văn hoá?
3. Tại sao nuôi cấy mô được sử dụng để nhân giống một số cây trồng hơn là chỉ trồng hạt giống?
4. Môi trường vô trùng là gì môi trường?
5. Tại sao môi trường vô trùng lại quan trọng trong mô văn hoá?
6. Bạn hoặc giáo viên của bạn đã khử trùng các dụng cụ đã được sử dụng như thế nào? được sử dụng trong nuôi cấy mô này hoạt động?
7. Chúng ta có thể khử trùng mô thực vật theo cách tương tự không? Tại sao hay tại sao không?
8. Điều gì sẽ xảy ra nếu bạn mở hộp đựng cây vô trùng của mình khi nó không ở trong vô trùng môi trường?

—

Miền trừ trách nhiệm: Nội dung khoa học trên chỉ mang tính chất tham khảo và không đại diện cho một nghiên cứu thực nghiệm cụ thể. Lý thuyết cơ bản không phản ánh chính xác quy trình và các bước thực nghiệm.